近日，中國科學院南海海洋研究所張長生研究員團隊在抗性基因介導海洋微生物天然產物結構多樣化研究中獲得新進展。研究揭示了糖苷酶KijX水解海洋微生物天然產物Lobophorin（LOBs）中的糖基側鏈，從而介導菌株對LOBs產生抗性的新機制，闡明了異源重組菌株中LOBs的結構多樣化是內源基因和外源基因簇間相互作用的結果，為抗生素耐藥性和結構多樣化研究提供了新思路。相關研究成果“A Widespread Glycosidase Confers Lobophorin Resistance and Host-Dependent Structural Diversity”發表于Angewandte Chemie International Edition (《德國應用化學》)，并被謎選為“Hot Paper”。
抗生素耐藥問題正在引發全球健康危機，普遍認為耐藥性的產生與抗生素的廣泛使用息息相關。但越來越多的研究發現，即使在人跡罕至的凍土和洞穴中發現的微生物中也存在抗生素抗性基因，表明環境微生物作為抗性基因的儲存庫，可能是臨床耐藥菌株中抗性因子的起源。這也提出了一個關于抗生素與其抗性基因演化過程中“先有雞還是先有蛋”的有趣問題：是抗生素的廣泛使用催生了抗性基因的進化，還是抗性基因本已古老存在，只是因抗生素的使用而加速了其發現過程？無論如何，從環境微生物中鑒別新的抗生素抗性基因，理解其生態功能，可以為抗生素的臨床耐藥性提供潛在的可控措施和解決方案。
LOBs屬于螺環乙酰乙酸內酯類抗生素，研究人員前期從海洋來源鏈霉菌Streptomyces sp. SCSIO 01127中分離到LOBs A/B，解析了LOBs生物合成中負責糖基化（LobG1、LobG2和LobG3）（Org Lett, 2013, 15, 1374-1377; Org Lett, 2020, 22, 1062-1066）、糖甲基化（LobS1）（Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97, 3885-3892）和C-32羥化（LobP1）（Chin J Chem, 2023, 41, 1478-1484）等后修飾酶的功能（圖1）。但在近期研究中發現一個特別的現象：與野生型菌株產物不同，異源重組菌株S. coelicolor M1154/pCSG5560（含有lob基因簇）中產生了一系列C-9位帶單糖且C-32位為羥甲基的LOBs，而意外的是，雖然LobP1體外反應確證其負責C-9位帶三糖或雙糖的LOBs的C-32位甲基羥化，但LobP1卻不能催化C-9位帶有單糖的LOBs發生羥化（圖1）。由此產生了異源重組菌株中這些C-9位帶單糖且C-32位為羥甲基的LOBs是如何產生的問題。
圖1. 野生型菌株（淺藍色）和異源表達菌株（淺黃色）中產生的代表性LOBs及部分后修飾酶的功能
基于上述問題，通過文獻調研和生物轉化實驗，研究人員在異源宿主中發現了一個糖苷酶KijX，可催化LOBs中C-9位多糖鏈的水解，但不能催化C-9位帶單糖的LOBs發生糖基水解（圖1）。在異源重組菌株S. coelicolor M1154/pCSG5560中，LOBs的合成經歷了LobG1（C-17糖基化），LobG3（C-9位連續添加兩個糖）和LobG2（C-9位的第三個糖）催化的糖基化，KijX催化的C-9位三糖（或雙糖）產物脫糖，LobG3催化的C-9位重新糖基化（單糖）的復雜過程（圖2）。通過外源基因簇lob和內源基因kijX之間相互作用，最終實現了LOBs的結構多樣化。
圖2.野生型菌株和異源重組菌株中LOBs產生的差異及菌株對LOBs產生抗性的分子機制
進一步的生物信息學分析發現，KijX的同源酶在細菌、真菌和古菌中廣泛存在。查詢到細菌來源KijX蛋白2323個，真核生物來源68個，古菌來源9個。體外酶學實驗顯示，在選取的56個不同來源的KijX同源蛋白（相似性28？91%）中51個有水解糖基的活性，部分同源蛋白的活性優于KijX。由于KijX同源蛋白廣泛存在于放線菌門中，推測該酶可能為放線菌對抗環境中LOBs的一種抗性機制。活性評價實驗顯示C-9位帶有單糖或無糖的LOBs對放線菌指示菌株沒有抑制活性；C-9位帶有三糖或雙糖的LOBs能夠抑制不含kijX及同源酶基因的放線菌的生長。導入kijX基因后，敏感菌株對LOBs產生抗性。相反，C-9位帶有三糖或雙糖的LOBs不能抑制含有kijX及同源基因的放線菌的生長，但敲除kijX及同源基因后，菌株對LOBs敏感（圖3）。這些實驗證實了kijX及其同源基因為LOBs的抗性基因。菌株間的拮抗實驗顯示同樣的結果，表明菌株通過產生LOBs來抑制同一生境中其他微生物的生長以獲得競爭優勢，體現了環境微生物間的一種共進化關系（圖3）。
圖3. kijX作為抗性基因的鑒定以及LOBs產生菌和非產生菌之間的拮抗作用
為了進一步闡明這類特殊糖苷酶的作用機制，研究人員解析了AcvX（KijX同源蛋白）的晶體結構。與AlphaFold2預測的15個其他KijX同源蛋白結構比較顯示，這類酶含有典型的GH113家族糖基水解酶的（β/α）8桶狀結構，但與典型GH113家族水解酶相比，KijX及其同源酶與底物結合的口袋呈現出特征的帶負電的凹槽，這個負電凹槽是該類酶特異性對LOBs產生水解作用的關鍵結構特征。進一步通過晶體疊加和點突變分析找到了該類蛋白可能的催化位點，并推測了其催化機制。
絕大多數KijX同源酶在本研究之前被注釋為未知功能蛋白，含有kijX的微生物在環境中分布非常廣泛，涵蓋了沙漠、海洋和深洞，以及人體和動物的腸道微生物。與此相反，含有LOB生物合成基因簇的微生物大多數來自于海洋環境。由此推測某些抗生素的抗性基因本已古老存在，抗生素的廣泛使用加速了其發現過程。kijX及其同源基因作為LOBs的抗性基因是巧合還是必然，是否其進化的目的是為抵抗環境中的LOBs均還未知，它們的原始生物學功能還有待進一步研究。
譚彬博士、張麗萍副研究員和張慶波研究員為本文共同第一作者，朱義廣和張長生研究員為共同通訊作者。該研究得到了國家重點研發計劃項目、國家自然科學基金重大項目、廣東省海洋經濟發展(海洋六大產業)專項資金項目、海南省重大科技計劃項目和中國科學院王寬誠率先人才計劃“盧嘉錫國際團隊項目”等資助。
相關論文信息：
A Widespread Glycosidase Confers Lobophorin Resistance and Host-Dependent Structural Diversity. https://doi.org/10.1002/anie.202302043
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