近日，南海海洋所張長生研究員團隊和廈門大學王斌舉教授團隊合作在P450酶催化糖肽分子內苯酚偶聯反應的機制研究方面取得新進展，相關成果“Discovery and Biosynthesis of Cihanmycins Reveal Cytochrome P450-Catalyzed Intramolecular C?O Phenol Coupling Reactions”發表于Journal of the American Chemical Society（《美國化學會志》）。南海海洋所博士方春艷、副研究員張麗萍和廈門大學博士生汪永超為論文共同第一作者，南海海洋所研究員張長生、研究員朱義廣和廈門大學教授王斌舉為共同通訊作者。
在化學生物學領域，細胞色素P450酶因其獨特、多樣的催化能力而備受矚目。P450酶催化的分子內C?O和C?C苯酚偶聯反應在天然產物生物合成中扮演著關鍵角色，廣泛存在于糖肽類抗生素如萬古霉素和替考拉寧中。雖然糖肽類抗生素中多個催化分子內苯酚偶聯反應P450酶的功能和晶體結構相繼被解析，但底物復合物結構的缺失導致該類反應的催化機制一直是未解之謎。
研究團隊從放線菌Amycolatopsis cihanbeyliensis DSM 45679中發現了C?O連接的新型雙環糖肽類化合物cihanmycins（CHMs,圖1）。CHM A (1)的結構通過X-ray單晶衍射確定為雙環糖肽，包含肉桂酰基團和兩個稀有的D-阿拉伯呋喃糖。研究團隊基于生物信息學分析和異源表達實驗，在DSM 45679的基因組中定位了CHM的基因簇，并通過體內基因敲除和體外生化實驗證實了3個P450酶的功能：Cih26負責肉桂酰基團的環氧化和羥化，Cih32負責三個氨基酸的羥化，Cih33及其同源蛋白DmlH和EpcH催化分子內C?O苯酚偶聯反應形成CHM的雙環骨架（圖1）。
圖1. CHM生物合成中3個P450酶的功能
為揭示Cih33及其同源蛋白催化C?O苯酚偶聯反應的機制，研究團隊開展了晶體學研究并解析了DmlH和DmlH?7復合物的晶體結構，首次揭開了分子內C?O苯酚偶聯P450酶與大環肽結合模式的神秘面紗。同時，單環底物7的柔性結構使其NMR信號裂分復雜，難以解析結構，而DmlH?7的結構獲取提供了通過復合物晶體鑒定小分子結構的經典案例。值得注意的是，底物7與DmlH的輔因子血紅素（heme）平面之間有一個水分子，可能在苯酚偶聯反應的攫氫過程中起關鍵作用。為驗證這一推測，研究團隊開展了分子動力學（MD）模擬和量子力學/分子力學（QM/MM）計算，揭示了DmlH催化分子內苯酚偶聯反應由水介導的雙自由基機制（圖2），首次提出了水分子在雙自由基苯酚偶聯反應中的重要作用。
圖2. 分子內苯酚偶聯反應由水介導的雙自由基機制（注：“*”為羥化氨基酸，“CM”為肉桂酰基團）
此外，基于生信分析，從數據庫中挖掘到81個含有Cih33同源蛋白的肽類基因簇。對這些基因簇的P450酶進行系統發育分析，發現催化分子內苯酚偶聯反應的Cih33/DmlH/EpcH和糖肽類抗生素的P450酶都聚集在同一分支，表明該分支中的其他P450酶可能具有相似的功能和機制，編碼這些P450酶的基因簇有望產生新穎的雙環肽類化合物。
綜上所述，本研究證實了雙環糖肽類化合物CHM生物合成中3個P450酶的功能，并利用酶學和計算化學等方法首次揭示了DmlH催化分子內苯酚偶聯反應由水介導的雙自由基機制，為深入理解P450酶催化的分子內苯酚偶聯反應提供了新的視角，還為發現和開發更多新穎的雙環肽類化合物奠定了研究基礎，有望為抗生素研發提供更多物質基礎。
以上研究工作得到了國家重點研發計劃“合成生物學”重點專項、國家自然科學基金委重大項目、中國科學院王寬誠率先人才計劃、廣東省自然科學基金等項目資助。
相關論文信息：Chunyan Fang?,Liping Zhang?,Yongchao Wang?,Weiliang Xiong,Zier Yan,Wenjun Zhang,Qingbo Zhang,Binju Wang*,Yiguang Zhu*,and Changsheng Zhang*. Discovery and Biosynthesis of Cihanmycins Reveal Cytochrome P450-Catalyzed Intramolecular C?O Phenol Coupling Reactions. J. Am. Chem. Soc. 2024. DOI: 10.1021/jacs.4c02841.
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