2024年6月18日，中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院唐士兵研究員與浙江大學楊兵研究員、北京航空航天大學劉超副教授團隊合作，報道了一種新型氟磺酸類可富集化學交聯的非天然氨基酸并在活細胞中研究蛋白質相互作用。相關成果以“Characterize direct protein interactions with enrichable,cleavable and latent bioreactive unnatural amino acids”為題發表在學術期刊Nature Communications。
蛋白質-蛋白質相互作用鑒定是蛋白質功能研究的重要步驟，在活細胞中原位鑒定相互作用蛋白對于生物醫藥研究具有重要意義。基于鄰近觸發反應（proximity-enabled reactivity）的化學交聯非天然氨基酸可以捕獲弱作用力和瞬時蛋白質相互作用，已被開發用于原位鑒定活細胞中的蛋白質相互作用。基于質譜的交聯肽段解析能夠提高互作蛋白鑒定的特異性、確定蛋白相互作用界面。然而，由于蛋白質樣品和質譜數據解析過程的復雜性，對蛋白質化學交聯后的交聯產物進行高通量鑒定具有挑戰性。在蛋白質樣品進行質譜分析前，對交聯肽段進行富集是提高鑒定效率的有效策略。
在本研究中，研究人員開發了一種基于化學基團氟磺酸的化學交聯非天然氨基酸，即可富集的氟磺酸-L-酪氨酸（enrichable fluorosulfate-L-tyrosine,eFSY）。利用密碼子擴展技術可以在蛋白質中特定位置插入具有潛在生物反應性的非天然氨基酸eFSY，eFSY中氟磺酸通過基于鄰近觸發反應誘導的硫-氟交換 (SuFEx) 點擊反應與相互作用蛋白中的酪氨酸、組氨酸或賴氨酸發生共價交聯。eFSY攜帶的炔基基團可以通過銅催化疊氮化物-炔環加成(CuAAC)點擊化學反應鏈接生物素，隨后就能實現交聯肽段的富集，從而提升鑒定交聯肽段的效率。此外，該研究發現氟磺酸基團介導的交聯產物在質譜中的混合性碎裂規律，其與組氨酸及賴氨酸交聯產生的磺酸酰胺鍵會在質譜中發生斷裂，與酪氨酸交聯后形成的磺酸酰胺鍵卻不會斷裂。為更好地應用該規律，該研究進一步開發了交聯鑒定軟件AixUaa。AixUaa可同時兼容并區分碎裂與不可碎裂兩種模式，實現了交聯肽段及位點的精確匹配，提升了交聯肽段的鑒定數量。應用此流程，研究人員分別在大腸桿菌及哺乳動物活細胞中系統性地鑒定了硫氧還蛋白 1 （Trx1） 和硒蛋白 M （SELM）的直接相互作用蛋白組，驗證了該方法的有效性。
總的來說，本研究開發的基于氟磺酸基團的可富集化學交聯非天然氨基酸eFSY及交聯鑒定軟件AixUaa顯著提升了在活細胞中鑒定相互作用蛋白中化學交聯肽段的效率，克服了以往化學交聯劑在鑒定蛋白質相互作用蛋白組的一些不足，有望應用于更廣泛的蛋白質相互作用研究。劉丹丹、丁文龍、程勁韜、韋秋實為本論文的共同第一作者，楊兵、唐士兵和劉超為共同通訊作者。該研究獲得了國家自然科學基金、國家重點研發計劃、浙江省自然科學基金和廣州健康院自主部署基礎研究項目等項目的資助。
圖1?新型含氟磺酸基團的可富集化學交聯劑eFSY研究蛋白質相互作用時，鑒定交聯肽段的流程圖（a），交聯肽段的碎裂規律（b）和交聯鑒定軟件AixUaa的開發流程（c）
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