人工合成的聚酰胺作為一類重要的工業(yè)材料，在汽車制造、輸油管道、電子電器、運動器材及醫(yī)療等行業(yè)具有廣泛應用，全球市場規(guī)模超過1000億元人民幣。中國作為全球最大的聚酰胺材料消費市場，年需求量達數百萬噸。然而，合成聚酰胺12的核心化學單體長期以來被少數幾家公司壟斷，給企業(yè)帶來較大的供應風險。此外，聚酰胺12的合成依賴于石油提取，且生產過程對環(huán)境污染較大，因此，開發(fā)更加綠色、可持續(xù)的聚酰胺12合成技術顯得尤為必要。
近日，由中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所合成生物化學研究中心的Howard H. Chou課題組在Metabolic Engineering期刊上發(fā)表了題為“Biosynthesis of 12-aminododecanoic acid from biomass sugars”的重要研究成果。
生物合成聚酰胺12的化學單體12-氨基十二烷酸（ADDA）面臨兩大技術瓶頸：其一，中間體十二烷酸（DDA）對底盤細胞具有毒性；其二，過氧化副產物十二烷二酸（DDDA）的積累會降低產率且增加生產成本。本研究基于合成生物學原理，闡明了這兩個技術瓶頸的機制，并開發(fā)了高產菌株。該項研究不僅深化了對DDA、ADDA和DDDA生物合成機理的理解，還為多種聚酰胺的綠色生產提供了新思路。
生物合成ADDA的研究目前主要使用植物油作為原料，面臨原料價格高、與食品生產形成資源競爭以及伴生的溫室氣體排放與生物多樣性破壞等多種挑戰(zhàn)。此外，生物合成ADDA的過程中會積累大量的DDDA，其合成機制至今尚不明確（Schrewe et al.,2013；Ladkau et al.,2016；Ahsan et al.,2018）。盡管已有研究利用葡萄糖合成了471.5 mg/L的ADDA，但DDA的細胞毒性問題仍限制了產量和產率的提升（Ge et al.，2025）。
雖然生物合成ADDA為聚酰胺12的可持續(xù)生產提供了新范式，但要實現綠色合成，仍需解決原料選擇、DDDA積累以及DDA細胞毒性等問題。
解決DDA的細胞毒性問題
DDA添加和硫酯酶（UcfatB）表達實驗表明，DDA對在生長中的細胞具有毒性，并提示過度的UcfatB表達會導致細胞進入不利于合成DDA的狀態(tài)。研究推測，利用群體感應表達（QSE）系統(tǒng)可能有助于調節(jié)UcfatB表達，從而促進DDA的合成。在細胞密度較低時，QSE系統(tǒng)可以在細胞較敏感的早期生長階段將UcfatB表達維持在較低水平，避免細胞毒性，同時實現DDA的積累。隨著細胞密度的增加，在敏感階段過后再提高UcfatB表達，可以最大化DDA的產量。與組成型表達系統(tǒng)相比，使用QSE系統(tǒng)在不誘導細胞毒性的情況下提高了DDA的產量。通過結合烷烴轉運蛋白（AlkL）與QSE系統(tǒng)，進一步優(yōu)化了該系統(tǒng)的動態(tài)性能，提高了表達強度和均勻性，并且降低了背景表達水平。
解決DDDA積累的問題
在將DDA轉化為ADDA的過程中，中間體12-氧代十二烷酸可能被不可逆地氧化為DDDA。過往研究證明，在大腸桿菌中敲除具有醛還原或氧化活性的酶可以提高芳香醛的積累（Kunjapur et al.，2014；Butler et al.，2023）。本研究通過敲除16個醛脫氫酶和還原酶，成功減少了DDDA的積累。
利用葡萄糖和纖維二糖合成ADDA
基于對DDA細胞毒性和DDDA合成機制的深入理解，研究人員對大腸桿菌進行了改造，使其能夠將葡萄糖和纖維二糖轉化為ADDA，同時減少DDDA的積累以及DDA對細胞生長的負面影響。在以纖維二糖為主要碳源的條件下，菌株M997實現了509 mg/L的ADDA產量。菌株M1001在15升發(fā)酵罐中達到了1035 mg/L，從糖到ADDA的轉化率為5%，且未檢測出DDDA的積累。
為了實現從葡萄糖和纖維二糖合成ADDA的一步法發(fā)酵工藝，本研究闡明了生物合成ADDA的瓶頸問題機制，發(fā)現生長中的細胞對DDA積累速率比最終DDA濃度更為敏感，解析了對DDDA積累的關鍵基因。研究通過改善QSE系統(tǒng)的性能，更嚴格地調控酶的轉錄，顯著提高了DDA和ADDA的合成效率。最后，開發(fā)的一步法生產ADDA工藝實現了迄今為止從糖合成ADDA的最高產量和產率，為未來更可持續(xù)地生產ADDA、聚酰胺12及其它聚酰胺產品提供了新的思路。
中國科學院深圳先進技術研究院碩士畢業(yè)生高海鑫及研究助理方強為文章共同第一作者，正高級工程師Howard H. Chou為文章的通訊作者。本研究得到了國家重點研發(fā)計劃、中國自然科學基金、深圳合成生物學創(chuàng)新研究院以及深圳合成生物研究重大科技基礎設施的支持。
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論文上線截圖
圖 1.優(yōu)化了QSE系統(tǒng)來精細控制DDA的合成。(a)OD600和DDA產量由組成型啟動子或基于QSE系統(tǒng)表達UcfatB。(b)基于QSE系統(tǒng)在不同誘導劑濃度下的表達強度。(c)對攜帶基于QSE系統(tǒng)并表達mCherry的細胞進行流式細胞術分析。
圖 2. 解析DDDA合成的機制。（a）依次敲除7個醛脫氫酶，以及(b) 單獨敲除9個醛氧化酶或還原酶對DDDA積累的影響。
圖 3. 高效從糖合成ADDA的菌株。(a) M631在表達與OsmY融合的β-葡萄糖苷酶（M997）并以纖維二糖為主要碳源。(b) M1001的發(fā)酵結果。
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