中科院深圳先進院合成所助理研究員倪磊、研究員金帆為共同通訊作者。
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文章鏈接：https://doi.org/10.1128/spectrum.03783-22
轉(zhuǎn)錄因子能夠以特定序列與基因?qū)Ｒ恍越Y(jié)合，保證目的基因以特定的強度在特定的時間空間表達。轉(zhuǎn)錄因子和DNA的相互作用在基因調(diào)控網(wǎng)絡(GRNs)中起著核心作用。目前檢測轉(zhuǎn)錄因子-DNA結(jié)合特異性的主要方法需要先對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA片段進行捕獲富集然后再進行測序（或其他分析），如染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP)、配體系統(tǒng)進化指數(shù)富集(SELEX)和DNA親和純化測序(DAP-Seq)等。這些方法涉及復雜的實驗程序，如基因組DNA的碎片化和擴增、轉(zhuǎn)錄因子的免疫沉淀等，較高的操作門檻不利于新手或跨學科人員快速展開實驗。
在本研究中，金帆團隊開發(fā)了一種名為AIDmut-Seq的體內(nèi)方法?；罨T導胞苷脫氨酶(AID)可以將單鏈DNA序列中的堿基C脫氨化形成堿基U， DNA復制后發(fā)生C-T或G-A替代。研究人員將AID融合到轉(zhuǎn)錄因子上，并在體內(nèi)誘導融合蛋白表達，這樣就可以在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點附近引入突變，后續(xù)可以通過全基因組測序直接檢測。由于不需要對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的片段進行捕獲富集，而僅需對突變標記進行測序，因此AIDmut-Seq的整個工作流程僅包含細菌培養(yǎng)、基因組提取和生信分析三個步驟（圖 1），不涉及其他復雜的實驗操作，大大節(jié)省了實驗人員的時間和勞動成本。
圖1 AIDmut-Seq的原理和步驟
研究人員使用不同類型的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子對AIDmut-Seq進行了驗證，表明該方法對大多數(shù)轉(zhuǎn)錄激活因子（如LasR，F(xiàn)leQ，ErdR，GacA，ExsA等）的具有較高效率。而對一些小的轉(zhuǎn)錄抑制因子（如RsaL和AmrZ等）雖然表現(xiàn)出較低的效率，但通過該方法計算得到的轉(zhuǎn)錄因子識別基序（motif）和現(xiàn)有方法得到的基序具有很大相似性。此外，使用AIDmut-Seq還得到了許多之前沒有發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和新的調(diào)節(jié)模式。這些結(jié)果證明了AIDmut-Seq的高效性和泛用性，可以作為現(xiàn)有方法的重要補充工具（圖2）。
圖2 AIDmut-Seq適用于大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子
研究人員將ADImut-Seq與目前最常用的ChIP-seq進行了“標桿測試”（benchmarking）。比較發(fā)現(xiàn)， AIDmut-Seq和ChIP-seq對TFBS具有相似的檢測精度，但AIDmut-seq具有更窄的檢測窗口。尤其對于啟動子上存在多個結(jié)合位點的位置，AIDmut-Seq相比ChIP-seq具有更好的分辨率，因此AIDmut-Seq在識別同一啟動子中的多個結(jié)合位點具有潛在的優(yōu)勢（圖3）。
圖3 AIDmut-Seq與ChIP-seq的比較
該研究得到了科技部重大研發(fā)計劃、國家自然科學基金、中國科學院科學儀器開發(fā)和深圳合成生物學創(chuàng)新研究院等項目支持。
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