維生素B5（又稱D-泛酸）在細胞中參與碳水化合物、脂肪和蛋白質的代謝，是人體必需的維生素之一，被廣泛應用于醫藥、飼料、食品、保健等領域。D-泛酸目前主要通過化學-酶法生產，該過程涉及大量含氰廢水的處理，隨著人們對環境保護的重視，該方法面臨著巨大的挑戰。微生物細胞工廠因其綠色環保的特點，是實現D-泛酸生產可持續發展的突破口。
文章上線截圖
文章鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.jafc.3c01082
武漢大學劉天罡教授與中科院深圳先進技術研究院馬田副研究員合作在Journal of Agricultural and Food Chemistry上發表題為“Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae for Vitamin B5 Production”的研究成果。該研究在釀酒酵母中構建了D-泛酸的高效合成途徑，并通過系統代謝工程對合成途徑進行優化，最終使用廉價培養基且無前體、無誘導劑、無抗生素添加，實現4.1 g/L D-泛酸的合成，是目前報道釀酒酵母從葡萄糖從頭合成D-泛酸的最高產量。
圖1. 本研究涉及的D-泛酸生物合成途徑
D-泛酸合成途徑關鍵酶的篩選及適配。該研究首先將D-泛酸的生物合成途徑設計為三個模塊：β-丙氨酸合成模塊、D-泛解酸合成模塊和兩者的縮合模塊，過程涉及7步關鍵酶（圖1）。將來自細菌、酵母、真菌、藻類、植物、動物等不同物種來源的功能酶以模塊為單位進行篩選，并通過組合篩選獲得最佳的元件適配組合。在釀酒酵母中構建了D-泛酸異源合成途徑，并實現利用基本碳源且無前體添加合成D-泛酸。
D-泛酸生物合成途徑的優化。為了進一步強化D-泛酸合成途徑，作者對三個模塊的基因進行拷貝數的優化，發現D-泛解酸合成模塊、β-丙氨酸合成模塊和前體縮合模塊拷貝數為3:1:2時，工程菌合成泛酸的能力最強。
另一方面，D-泛酸合成途徑中存在多個競爭途徑，作者圍繞丙酮酸與酮異戊酸兩個關鍵中間代謝物對不同競爭途徑進行了刪減或削弱。通過對競爭途徑關鍵基因的敲除，作者發現leu4、bat1、gpd1和gpd2四個潛在D-泛酸增產的有效位點。隨后，通過過表達pos5平衡細胞內的氧化還原力，過表達mae1增加前體丙酮酸，獲得D-泛酸高產菌株。
D-泛酸高產菌的發酵優化。在以上研究中，關鍵基因的表達受半乳糖誘導型啟動子調控，作者將關鍵調控基因gal80敲除，使基因的過表達僅通過葡萄糖調控，獲得工程菌DPA171。在發酵罐中對菌株DPA171進行發酵條件優化，通過控制補料階段乙醇的濃度在5 g/L以下，在不添加誘導劑、前體、抗生素等成分的條件下，以葡萄糖為碳源從頭合成，實現4.1 g/L D-泛酸的合成。
圖2. 釀酒酵母細胞工廠高產D-泛酸
綜上，本研究首次在釀酒酵母中構建了完整的D-泛酸異源合成途徑，并進行系統代謝工程實現以葡萄糖為碳源從頭合成D-泛酸，為構建維生素類細胞工廠提供了指導。
本論文以武漢大學碩士生郭加璇為第一作者，以劉天罡教授和馬田副研究員為共同通訊作者。該研究工作得到國家重點研發計劃和武漢合生科技有限公司支持。
通訊作者簡介：
馬田博士，中國科學院深圳先進技術研究院副研究員。主要致力于探索微生物高效合成的代謝機理及工程手段以實現目標生物源藥物的綠色制造。研究成果以第一作者或通訊作者發表在Nature Communications、Metabolic Engineering等。轉化成果被評為2018年湖北十大科技事件、2019年湖北省科技進步一等獎。
課題組面向微生物綠色制造方向，現招聘博士后和研究助理，以微生物學、生物化學、分子生物學背景優先，歡迎感興趣的同志投遞簡歷至郵箱tian.ma@siat.ac.cn。
附件下載：