5月11日，中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所馬英新課題組與湖北大學印文博士合作在Analytical Chemistry上發表了題為《Fluorescence and Colorimetric Analysis of African Swine Fever Virus Based on RPA-Assisted CRISPR/Cas12a Strategy》的補充封面論文。該論文首次構建了基于RPA-CRISPR/Cas12a系統的非洲豬瘟病毒（ASFV）比色-熒光雙模式檢測策略，通過構建新型磁珠-酶報告系統，結合RPA-CRISPR/Cas12a技術，實現了對ASFV基因的比色-熒光雙模式精準檢測。該方法能實現對單拷貝病毒基因組檢測，可用于便攜式可視化診斷，且在臨床樣本應用中展現了良好的檢測性能，為病毒感染的快速、精準診斷提供了有力工具。
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上線鏈接：https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acs.analchem.3c01033
非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種急性、出血性、高傳染性的豬疾病。迄今為止，仍然沒有廣泛有效的疫苗和治療方式用于應對非洲豬瘟，通常依靠快速診斷和撲殺感染豬等手段對疫情進行有效控制。目前，對于非洲豬瘟的診斷主要依賴于PCR技術，該技術依賴于儀器設備和專業操作人員，只能在實驗室中進行，無法滿足現場診斷的需求。等溫擴增技術，如重組酶聚合酶擴增（RPA）、滾環擴增（RCA）等，具有高效、簡便易行等優勢，但其靈敏度有限，難以單獨用于分子診斷。通過與CRISPR/Cas系統聯用，靈敏度顯著提高，可增加分子診斷的準確性。然而，目前常用的單模式熒光檢測法或比色檢測法易受到環境干擾，造成檢測結果的不準確。
本研究開發了一種結合RPA、CRISPR/Cas12a和磁珠-酶新型報告系統，用于ASFV基因的快速精準診斷的方法。如圖1所示，biotin-ssDNA-azide與DBCO修飾的堿性磷酸酶（ALP）通過點擊化學反應合成biotin-ssDNA-ALP，biotin-ssDNA-ALP與鏈霉親和素修飾的磁珠（SA-MB）結合獲得MB-ssDNA-ALP報告系統。用RPA擴增ASFV基因序列，獲得擴增子，擴增子與Cas12a-crRNA復合物結合，激活Cas12a反式切割活性，切割MB-ssDNA-ALP上的ssDNA，釋放ALP；ALP催化pNPP水解生成pNP，引起比色信號變化，再加入量子點作為熒光報告子，實現比色和熒光的雙模式信號輸出。
圖1 探針構建及ASFV檢測原理圖。biotin-ssDNA-azide與DBCO-ALP通過點擊化學反應獲得biotin-ssDNA-ALP，biotin-ssDNA-ALP與SA-MB偶聯獲得MB-ssDNA-ALP報告子。RPA擴增ASFV基因，擴增子激活Cas12a-crRNA復合物，Cas12a非特異性切割biotin-ssDNA-ALP報告子，釋放ALP；ALP水解pNPP，生成黃色pNP，加入藍色QDs后，在內濾效應作用下，藍色QDs熒光被猝滅。
在該研究中，團隊首先合成、表征了biotin-ssDNA-ALP，并驗證了biotin-ssDNA-N3與DBCO修飾ALP的偶聯以及MB-ssDNA-ALP探針的合成。然后，考察了RPA擴增ASFV基因的能力。以高度保守的ASFV B646L基因為靶標，設計了三對RPA引物，通過瓊脂糖凝膠電泳實驗驗證了三對引物都可高效擴增ASFV基因。接著，驗證了CRISPR/Cas12a靶向剪切ASFV基因的能力。設計靶向三個RPA擴增子序列的crRNA，利用瓊脂糖凝膠電泳驗證了Cas12a被激活并切割RPA擴增子。最后，結合合成的MB-ssDNA-ALP探針、RPA-CRISPR/Cas12a系統以及藍色CdZnSe QDs，實現了對ASFV基因的比色-熒光雙模式精準檢測，靈敏度達20 copies/mL，可視化檢測104 copies/mL（圖 2A-2D）。磁分離技術的使用可有效降低背景信號，實現高信噪比檢測。對比發現本研究開發的檢測方法靈敏度高于qPCR，且具有良好的特異性，探針不與其它豬疾病相關病毒產生交叉反應。同時，還探究了該方法在實際樣本中的檢測能力，對12份豬血真實樣本進行了分析，結果顯示該檢測方法具有100%的準確度（圖2E和2F）。本方法結合熒光法的高靈敏度和比色法的易讀性，具有良好的靈敏度、便攜性和特異性，為病毒感染的快速、精準診斷提供了有效工具。
圖2 比色-熒光雙模式檢測ASFV基因。（A）不同濃度ASFV基因下，pNP的紫外光譜。（B）400 nm處吸光度與ASFV基因濃度的對數值之間的線性關系。（C）不同濃度ASFV基因下，CdZnSe QDs的熒光光譜。（D）熒光強度變化與ASFV基因濃度的對數值之間的線性關系。比色（E）和熒光（F）檢測方法用于臨床樣本的分析結果。可視化檢測結果均列于圖片上方。
中科院深圳先進院合成生物學研究所的毛國斌副研究員和中科院深圳先進院與華中農業大學聯合培養碩士研究生羅杏為文章并列第一作者。中科院深圳先進院合成生物學研究所的馬英新研究員、毛國斌副研究員和湖北大學印文博士為該論文的共同通訊作者。華中農業大學何進教授、王璕副教授參與了該研究，復旦大學孔繼烈教授提供了樣本支持。該項目得到國家自然科學基金、科技部、中國科學院、廣東省、深圳市及深圳合成生物學創新研究院等多個項目的支持。
補充封面（supplementary cover story）
超高靈敏CRISPR/Cas12a分子診斷傳感器構建用于非洲豬瘟病毒感染快速篩查
PI與課題組簡介：
馬英新博士，中國科學院深圳先進技術研究院研究員，博士生導師，國家自然科學基金優秀青年項目獲得者，國家重點研發計劃青年首席科學家，近5年主持1項國家自然科學基金優秀青年項目、1項科技部重點研發計劃青年項目、1項國家自然科學基金青年項目、1項廣東省杰出青年基金項目、1項深圳市優秀科技創新人才培養項目、1項中科院深圳先進院優青項目和1項博士后科學基金面上項目，并獲批了中國科學院青年創新促進會、深圳市高層次人才、博士后創新人才支持計劃等人才計劃。
以第一/通訊作者身份在J. Am. Chem. Soc.、Nat. Commun.、ACS Nano、Sci China Life Sci、Anal. Chem.、ACS Appl. Mater. Interfaces、Nano Res等國際著名雜志發表論文30余篇。
課題組長期面向：
1）有微生物學、噬菌體學、合成生物學、分子生物學、分析化學、生物醫學等學科研究背景者；
2）有分子病毒學、噬菌體學、合成生物學、分子生物學、生物傳感技術開發等工作經驗者；
3）納米合成生物學等交叉學科背景的專業人才招聘博士后。
有意申請者請將個人簡歷（要求為PDF）以發送至：yx.ma1@siat.ac.cn，簡歷及郵件標題注明“應聘崗位-學校名稱-專業-姓名”。
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