塑料的發明為我們的日常生活帶來了極大的便利。但是，大規模塑料垃圾的產生以及不當的處理方式，使得塑料垃圾（白色污染）成為當下最為嚴峻的環境問題之一。
8月21日，中國科學院深圳先進技術研究院戴卓君課題組在Nature子刊Nature Chemical Biology發表題為“Degradable living plastics programmed by engineered spores”的研究工作。該工作通過對微生物進行基因編輯并產生具備極端環境耐受能力的孢子，使其可以在特定條件下分泌塑料降解酶；并通過塑料加工方法（高溫、高壓或有機溶劑）將孢子包埋在塑料基質中。
文章上線截圖
日常使用環境中，孢子保持休眠狀態，塑料也可保持穩定的使用性能。在特定條件下（表面侵蝕、堆肥），塑料中的孢子被激活并啟動降解程序，完成塑料的完全降解（圖1）。
圖1. 整體研究思路
研究背景
2016年，Yoshida等人報道了土壤細菌Ideonella sakaiensis，該菌株生長在日本一個塑料回收設施附近受PET污染的沉積物中（Science,2016）。這種革蘭氏陰性、需氧、桿狀的細菌具有非凡的能力，能夠通過表達兩個關鍵酶：PETase及MHETase，從而利用PET作為其生長所需要的主要碳源。在之后的一系列研究中，大量合成生物學領域的工作圍繞著塑料降解相關酶的挖掘、設計、進化及改造開展，但鮮有工作關注可降解塑料的合成方法創新。
2018年及2021年，具有高分子物理背景的Ting Xu課題組（University of California,Berkeley）先后在Science和Nature發表文章，從另一個視角和維度推進了可降解塑料的研發。在2018年的Science中，研究團隊開發出一種由四種單體合成的聚合物(RHPs,random heteropolymers)，每種單體亞單位能與目標蛋白表面上的化學片段相互作用。這些單體亞單位相互連接模擬天然蛋白，從而使得它們與蛋白表面之間的相互作用的靈活性實現最大化，這種基于相互作用的理性設計使蛋白質在無細胞合成中進行正確折疊，并保持水溶性蛋白質在有機溶劑中的活性。
在這個工作的基礎上，Ting Xu的團隊將塑料降解酶，RHPs與塑料母粒（聚己內酯，PCL）進行混合加工，RHPs保護了水解酶在苛刻的塑料加工環境中的生物學功能。在無水環境下塑料可以穩定使用，而在有水環境或堆肥條件下可以迅速降解（Nature,2021）。
將降解酶預置在塑料里需要平衡加工過程中的極端環境與酶的穩定性。盡管Ting Xu團隊的精彩工作提出了通過RHPs調節蛋白質穩定性這一確定方案，但是該方法的推廣仍有諸多挑戰。首先RHPs的合成難度高，即使對于具有一般化學合成背景的實驗室也并非易事；其次，PCL加工溫度（80-120攝氏度）在塑料家族中幾乎是最低的，常見的塑料加工溫度大多大于200攝氏度，其中PET（聚對苯二甲酸乙二醇酯）的加工溫度更高達300攝氏度，RHPs的保護能力在這些體系中面臨巨大挑戰。
沉睡的孢子與活塑料
在自然億萬年的演化下，諸多微生物進化出了針對惡劣環境條件的抵抗力。當極端環境到來，不再適合生存和繁殖的時候，細菌就會轉變成孢子的形式。這種轉變可以讓細菌獲得超強的抵御能力。孢子可以忍受極端的干燥、溫度和壓力，而這些極端環境恰好存在于塑料加工的環境中。由此，研究團隊提出通過合成生物學方法改造枯草芽孢桿菌，將可控分泌塑料降解酶（洋蔥霍爾德菌脂肪酶，Lipase BC）的基因線路導入枯草芽孢桿菌，并在二價錳離子的脅迫環境中，迫使枯草芽孢桿菌“休眠”，形成孢子形態。產生的孢子同樣帶有編輯的基因線路，并且相比于細菌還具備了針對高溫、高壓、有機溶劑和干燥的耐受性。
研究團隊將工程化改造的孢子溶液與PCL塑料母粒直接混合，通過高溫熔融擠出或者有機溶劑方法制備了一系列含有孢子的塑料。在物理性能方面的各項測試中，研究團隊發現活塑料與PCL普通塑料，在屈服強度、應力極限、最大形變量和熔點等參數上均沒有顯著區別。日常使用環境中,孢子保持休眠狀態，塑料也可保持穩定的使用性能（圖2）。
圖2. 普通PCL塑料和“活”塑料的宏觀、微觀照片
孢子的釋放及降解過程的啟動
塑料降解的第一步，是需要將活體塑料內部的孢子成功釋放并重新復蘇生長。研究人員首先嘗試了兩種孢子釋放的方式。一種方法是利用南極假絲酵母脂肪酶B（Lipase?CA）對塑料表面進行侵蝕。Lipase CA對PCL塑料的水解作用是一種“剪刀”形式（圖3），在宏觀上表現為對PCL塑料的外部破碎作用。
圖3.?兩種酶對PCL塑料的降解機理示意圖
在Lipase CA的作用下，PCL表面被破壞，包埋在材料內部的工程化孢子被釋放到外界環境中，并開始復蘇生長，啟動Lipase BC的表達。Lipase BC會與PCL高分子鏈末端結合，進而將PCL分子鏈一步步完全降解（最終降解分子量<500 g/mol）。結果表明，活體塑料可以在6-7天內迅速降解，而只有表面破壞（Lipase CA）作用的普通PCL塑料即使在21天后，也有大量的塑料碎片存在（圖4）。
圖4. 兩種酶對PCL塑料，降解前后的表面結構和分子量變化。(a) CA酶處理普通PCL塑料（左）和活體功能塑料（右）的降解效果；(b)活PCL降解過程中分子量變化曲線；(c) 僅CA酶對普通PCL塑料降解過程中分子量變化曲線
另一種孢子釋放的方法是堆肥，在不需要任何其他外源制劑的加入下，土壤環境中活塑料能夠在25-30天以內就可被完全降解。而傳統PCL塑料則需要55天左右才能被降解至肉眼不可見（圖5）。
圖5. “活”塑料在土壤條件下的堆埋降解。(a)?活體塑料在土壤環境中降解；(b) 普通PCL塑料在土壤環境中降解
前面提到，在塑料家族中，PCL的加工條件實際較為“溫和”，本研究中選擇PCL體系更多是由于其高效的酶降解系統基礎：Lipase BC作為一種processive enzyme可以捕捉PCL鏈進行完全降解。
因此為了驗證系統的普適性，研究團隊繼續嘗試了其他的塑料體系，將帶有綠色熒光質粒的孢子分別與PBS（聚丁二酸丁二醇酯）、 PBAT（聚己二酸對苯二甲酸丁二醇酯）、 PLA（聚乳酸）、PHA（聚羥基脂肪酸酯）甚至PET（聚對苯二甲酸乙二醇酯）進行混合加工，其中PET的加工溫度高達300攝氏度，之后通過物理研磨的方法對孢子進行了釋放。有趣的是，即使從PET塑料中釋放出來的孢子依舊可以復蘇并重新表達綠色熒光。這也為制作其他基底的活塑料奠定了良好的基礎（圖6）。
圖6. 其他基底“活”塑料。(a)?其他塑料種類及其加工溫度；(b) 熱熔制備多種基底的“活”塑料；(c) 物理破碎塑料，釋放并激活攜帶綠色熒光蛋白的孢子；(d) 研磨破碎“活”塑料；(e) 工程化孢子成功釋放并表達綠色熒光蛋白
為了驗證系統的放大可能，研究團隊還使用單螺桿擠出機進行了小規模工業化測試，經過上述方法得到的活體的PCL塑料，依然具有快速高效的降解效率（圖7）。并且，研究人員還將活體塑料置于雪碧環境中浸泡2個月，在沒有外界作用的情況下，活體塑料能夠保持穩定的外形，說明活體塑料能夠像傳統塑料一樣使用，只有在它們被破壞或被廢棄的條件下，才會啟動降解程序。這項研究為新型可生物降解塑料的開發，提供了新的視角和方法，有望助力解決當下嚴重的塑料污染困境。
圖7. 單螺桿擠出機制備“活”塑料，及其降解性能測試。(a)?單螺桿擠出機制備得到的活體功能塑料；(b) 單螺桿制備活體功能材料的降解測試
戴卓君研究員為論文通訊作者，戴卓君課題組聯培博士唐琛望為論文第一作者，王林及孫靜在實驗設計、推進和文章修訂中做出了重要貢獻。該研究獲得國家重點研發計劃等多個項目的支持。
參考文獻：
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[3]??DelRe C,Jiang Y,Kang P,?et al. Near-complete depolymerization of polyesters with?nano-dispersed enzymes[J]. Nature,?2021,592:?558–563.
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