4月13日，中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院司同課題組在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊ACS Catalysis在線發(fā)表研究論文“RhlA Exhibits Dual Thioesterase and Acyltransferase Activities during Rhamnolipid Biosynthesis”。鼠李糖脂（Rhamnolipid，RL）是一種最具應(yīng)用潛力的生物表面活性劑。RhlA酶是影響RL產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素，但其序列-結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系尚不清楚，且催化機(jī)制存在爭(zhēng)議。研究團(tuán)隊(duì)依托深圳合成生物研究重大科技基礎(chǔ)設(shè)施，首次解析了RhlA的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，意外的發(fā)現(xiàn)游離3-羥基脂肪酸可以作為RL生物合成過程的中間體，證實(shí)了RhlA具有雙重硫酸酯酶和酰基轉(zhuǎn)移酶活性。通過結(jié)合半理性設(shè)計(jì)與高通量質(zhì)譜篩選，團(tuán)隊(duì)獲得了底物選擇性顯著改變的RhlA突變體，這一研究為未來鼠李糖脂產(chǎn)品高效、特異性工業(yè)化生產(chǎn)提供機(jī)制基礎(chǔ)和技術(shù)借鑒。本文的第一作者是課題組助理研究員唐婷博士，通訊作者為司同研究員和張建志助理研究員。
文章上線截圖
文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.3c00046
生物表面活性劑是由動(dòng)植物和微生物生成的表面活性分子；相較于化學(xué)合成表面活性劑，它們的結(jié)構(gòu)更加多樣，并且具有良好的環(huán)境兼容性。因此，生物表面活性劑可以作為洗滌劑、乳化劑、潤(rùn)濕劑、發(fā)泡劑和分散劑等重要化工產(chǎn)品的綠色替代原料。鼠李糖脂具有顯著降低流動(dòng)相間表/界面張力的能力，且具有優(yōu)異的起泡、乳化和絮凝作用，同時(shí)具備穩(wěn)定性、低毒性和生物可降解性等優(yōu)點(diǎn)。因此，在石油、環(huán)境、農(nóng)業(yè)、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。美國(guó)Jeneil公司研制的生物基鼠李糖脂產(chǎn)品于2004年榮獲美國(guó)聯(lián)邦環(huán)保署頒發(fā)的“總統(tǒng)綠色化學(xué)挑戰(zhàn)獎(jiǎng)”。
盡管如此，鼠李糖脂的大規(guī)模應(yīng)用仍受制于高昂的生產(chǎn)成本，其中約70%為分離成本；一個(gè)重要原因是生物合成的鼠李糖脂中存在大量結(jié)構(gòu)相似、難以分離的同系物。深入研究和改造鼠李糖脂生物合成途徑，有助于實(shí)現(xiàn)目標(biāo)同系物的高效特異性生產(chǎn)，從而降低分離成本，促進(jìn)工業(yè)生產(chǎn)和市場(chǎng)推廣，實(shí)現(xiàn)對(duì)合成表面活性劑的綠色替代。
RhlA是影響RL分子結(jié)構(gòu)多樣的關(guān)鍵因素。RhlA催化合成RL的疏水模塊——3-羥基烷酰基-3-羥基烷酸（HAA），該酶的底物選擇性決定了疏水模塊中脂肪鏈的長(zhǎng)度和不飽和度，進(jìn)而影響RL的理化性質(zhì)和生物活性。然而，由于實(shí)驗(yàn)手段的限制，RhlA底物選擇性的機(jī)制解析和工程改造尚處于起步階段。例如，迄今為止尚無RhlA蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的報(bào)道，而同源結(jié)構(gòu)建模指導(dǎo)下的半理性設(shè)計(jì)未能有效改變RhlA底物選擇性。另外，鼠李糖脂同系物之間僅存在精細(xì)的分子結(jié)構(gòu)差異，定性和定量分析需要依賴色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法，其較低的分析速度（30分鐘/樣品）也限制了定向進(jìn)化策略的應(yīng)用。
為克服這些局限，本研究通過X射線晶體學(xué)方法首次解析了銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)來源RhlA的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，揭示了RhlA具有α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)。出乎意料的是，除Ser-His-Asp催化中心附近經(jīng)典的配體結(jié)合口袋1外，研究人員還發(fā)現(xiàn)了另外一個(gè)配體結(jié)合口袋2，該口袋中結(jié)合有游離的3-羥基脂肪酸，推測(cè)可能是反應(yīng)中間體。
綜合應(yīng)用同位素標(biāo)記、體外學(xué)表征、以及QM/MM計(jì)算模擬手段，研究人員驗(yàn)證了RhlA在體外反應(yīng)中具有硫酸酯酶活性，可以催化酰基-ACP（acyl carrier protein, 酰基載體蛋白）底物水解生成游離3-羥基脂肪酸。同時(shí)，團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)游離3-羥基脂肪酸也可以作為酰基受體，在RhlA酰基轉(zhuǎn)移酶活性的催化作用下與酰基-ACP供體形成HAA，但是該路徑在整體反應(yīng)中的貢獻(xiàn)占比較小。
研究人員進(jìn)一步應(yīng)用半理性設(shè)計(jì)，針對(duì)兩個(gè)結(jié)合口袋中的13個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)構(gòu)建了定點(diǎn)飽和突變文庫(kù)，應(yīng)用高通量MALDI-TOF質(zhì)譜方法篩選了上千株突變株，最終得到了RhlA底物選擇性顯著變化的9個(gè)突變體，并發(fā)現(xiàn)不同結(jié)合口袋的突變對(duì)于HAA中兩個(gè)脂肪鏈的長(zhǎng)度具有不同的調(diào)節(jié)作用。團(tuán)隊(duì)對(duì)RhlA的三個(gè)典型突變體（Met37Phe、Phe43His和Ala101Met）開展了重組表達(dá)、蛋白純化與體外酶動(dòng)力學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)kcat是決定發(fā)酵液中不同RL同系物比例的關(guān)鍵參素。
值得指出的是，盡管本研究解析了RhlA酶一個(gè)可能的反應(yīng)路徑，但由于未獲得RhlA和酰基-ACP底物的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)，RhlA的催化機(jī)理仍有待進(jìn)一步闡明。
該成果得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2020YFA090023和2021YFA0910800）、國(guó)家自然科學(xué)基金（32071428）、廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金（2022A1515110680）、中科院戰(zhàn)略先導(dǎo)項(xiàng)目（XDB0480000）、深圳華大研究院開發(fā)基金（BGIRSZ20210003）及深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院的支持。作者特別致謝上海同步輻射光源和深圳合成生物研究重大科技基礎(chǔ)設(shè)施對(duì)于X-射線晶體衍射和高通量質(zhì)譜篩選研究的幫助。
附件下載：